Draft protocol for fungal dna extraction from sputum or bal fluid specimens

Para uso diagnóstico in vitro: MycXtra®
MycXtra®
Kit de extracción de ADN fúngico
REF 080-005
Uso previsto
El Kit de extracción de ADN fúngico MycXtra® está diseñado para el aislamiento y la purificación del ADN fúngico
presente en el lavado broncoalveolar (bronchoalveolar lavage, BAL), en el esputo y en otras muestras del tracto
respiratorio inferior de seres humanos.
Resumen y explicación
El kit está diseñado para aislar ADN de origen fúngico en muestras humanas del tracto respiratorio inferior de pacientes
en los que se sospecha una infección fúngica. La extracción del ADN fúngico es un primer paso crítico para el análisis
del ADN específico de hongo en la muestra. Dado que las paredes celulares fúngicas son difíciles de romper, se requiere
una combinación de procesos para optimizar el rendimiento; la aplicación de fuerzas mecánicas directas en el tampón,
seguido de varios pasos de purificación para eliminar sustancias inhibidoras de la reacción en cadena de la polimerasa
(polymerase chain reaction, PCR), componentes de la pared celular y de la matriz humana, seguido de una elución en
tampón. La calidad del ADN purificado es adecuada para un análisis de PCR en tiempo real.
Principios del procedimiento
Las esporas e hifas fúngicas presentes en la muestra se concentran por centrifugación y se vuelven a suspender en un
volumen pequeño. A continuación se añade la muestra a un tubo batidor de microesferas que contiene microesferas,
solución de lisis, solución de microesferas y solución para eliminar el inhibidor. El principio consiste en lisar los
microorganismos en la muestra con una combinación de detergente y la fuerza mecánica ejercida contra las
microesferas especializadas. Los componentes celulares se lisan mediante acción mecánica en un agitador vorticial. El
ADN liberado de las células lisadas se une a un filtro de centrifugadora de sílice. Se lava el filtro y el ADN se recupera en
una solución tampón y ahora está listo para análisis posteriores de PCR.
Contenido del kit
ƒ Suficiente para 10 muestras de paciente
10 tubos de 2 mL con solución de 0,55 microesferas Solución S1 ƒ 10 unidades de filtros de centrifugadora en tubos de 2 mL ƒ 40 tubos de microcentrifugadora (2 mL) ƒ Instrucciones de uso Almacenamiento
El kit se debe guardar a temperatura ambiente (15–30 °C) hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta de la caja
del kit, fecha en la cual se deberá desechar de acuerdo con las normas locales.
Advertencias y precauciones
El kit está diseñado para ser usado solamente por profesionales de laboratorio. Se requiere el uso de prácticas y
procedimientos de seguridad biológica de nivel 2, equipo e instalaciones de contención para la manipulación de
muestras clínicas sin generación de aerosoles. Todas las actividades que generan aerosoles deben realizarse en una
cámara de seguridad biológica de clases II o III. En las muestras clínicas puede haber presentes microorganismos
patógenos, incluidos entre otros los virus de la hepatitis y el virus de inmunodeficiencia humana. Se deben seguir las
precauciones estándar y las directrices institucionales durante la manipulación de todo el material contaminado con
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MycXtra®
sangre y otros líquidos corporales. El kit contiene pequeñas cantidades de: etanol, dodecilsulfato sódico, clorhidrato de guanidina e isotiocianato de guanidina. Myconostica Ltd. tiene a su disposición una Hoja de datos sobre la seguridad de los materiales (Material Safety Data Sheet, MSDS). Equipo requerido
ƒ Microcentrifugadora (10.000 x g)
ƒ Centrifugadora de todo uso
ƒ Micropipetas con puntas con filtro estériles (volúmenes requeridos: 40 μL–1.000 μL).
ƒ Agitador vorticial Vortex-Genie 2 (de Scientific Industries, pero disponible en proveedores locales).
ƒ Placa adaptadora para el agitador vorticial (a la venta en Myconostica, REF 080-015) para colocar los tubos en el
Notas del procedimiento
El proceso lleva aproximadamente 1,5 horas. Si la muestra corresponde a esputo o si la muestra de BAL aparece
viscosa, es necesario realizar un tratamiento previo adicional, según se describe más adelante en la sección
Procedimiento para esputos u otras muestras respiratorias viscosas.

Lea el protocolo completo antes de empezar. Use guantes en todo momento. Se deben tapar todos los tubos
cuando se realizan las etapas de mezclado en agitador vorticial. Utilice micropipetas para transferir líquidos. No
se olvide de identificar debidamente los tubos cuando se estén procesando muestras de varios pacientes.
Procedimiento para obtener muestras de BAL transparentes, que fluyen libremente:
Nota: Si la muestra de ADN extraído se va a usar subsiguientemente con un producto MycAssayTM de Myconostica,
recomendamos comenzar con ≥ 2 mL de BAL.
1. Centrifugue la muestra de BAL durante 20 minutos a 3.000 x g. Decante el sobrenadante y consérvelo. 2. Devuelva 800 µL del sobrenadante que ha conservado al sedimento, vuelva a suspender y transfiera a un tubo de 3. Centrifugue durante 2 minutos a 10.000 x g y, a continuación, retire todo el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento en la solución que ha quedado en el tubo y transfiera toda la cantidad a un tubo de solución de microesferas de 2 mL. 4. Inviértalo con cuidado para mezclarlo.
5. Compruebe la solución S1. Si la solución S1 ha precipitado, caliente el tubo con la mano y mezcle mediante
6. Añada 60 µL de Solución S1 al tubo de solución de microesferas e invierta el tubo varias veces o agítelo brevemente 7. Añada 200 µL de Solución IRS (solución para eliminar el inhibidor) al tubo de solución de microesferas. 8. Coloque el (los) tubo(s) de microesferas horizontalmente en una placa adaptadora de agitador vorticial (a la venta en Myconostica, REF 080-015). Agite mediante agitación vorticial a la velocidad máxima durante 10 min. 9. Centrifugue el(los) tubo(s) de solución de microesferas a 10.000 x g durante 30 segundos. Asegúrese de no exceder la velocidad de 10.000 x g o los tubos podrían romperse. Asegúrese de que los tubos de 2 mL giren libremente en la centrifugadora sin rozamiento. 10. Transfiera 450 µL del sobrenadante a un tubo de microcentrifugadora limpio (suministrado) teniendo cuidado de no alterar las microesferas. Deseche el tubo de solución de microesferas. 11. Añada 250 µL de Solución S2 al sobrenadante y agite mediante agitación vorticial durante 5 s. Incube a 4–8 °C 12. Centrifugue los tubos durante 1 min a 10.000 x g. 13. Evitando el sedimento, transfiera todo el volumen del sobrenadante a un tubo de microcentrifugadora limpio 14. Añada 1,1 mL (2 x 550 µL) de Solución S3 al sobrenadante (tenga cuidado al hacerlo, ya que el tubo está casi lleno). 15. Cargue aproximadamente 650 μL en un filtro de centrifugadora y centrifugue a 10.000 x g durante 30 s. Deseche el líquido que atraviese el filtro, añada otros 650 μL de sobrenadante al filtro de centrifugadora y centrifugue a
10.000 x g durante 30 s. Repita el proceso hasta que todo el sobrenadante haya pasado a través del filtro de
centrifugadora. Nota: Para cada muestra se requiere un total de tres cargas. En la última centrifugación, centrifugue
a 10.000 x g durante 1 min. Deseche el líquido que atraviese el filtro.
16. Añada 300 µL de Solución S4 al filtro de centrifugadora y centrifugue durante 30 s a 10.000 x g. 17. Deseche el líquido que atraviese el filtro. 18. Centrifugue de nuevo durante 1 min para eliminar los últimos restos de S4 que inhibirían la reacción de PCR. 19. Coloque con cuidado el filtro de centrifugadora en un nuevo tubo de microcentrifugadora limpio (suministrado). Evite el paso de cualquier resto de Solución S4 al filtro de centrifugadora. Español–2
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20. Añada con cuidado 40 μL de Solución S5 al centro de la membrana del filtro de centrifugadora de color blanco. Deje 21. Centrifugue durante 30 s a 10.000 x g. 22. Deseche el filtro de centrifugadora. El ADN del tubo está listo ahora para ser usado en una aplicación de PCR. Se puede guardar a 2–8 °C hasta un máximo de 5 días; para un plazo más largo guarde el ADN congelado a -20 °C. 23. Puede procesarse un máximo de 10 muestras de BAL. Si no se usan todos los componentes de una vez, devuelva los componentes del kit a la bolsa original. No mezcle lotes diferentes. 24. Cuando el procesamiento se haya completado, se deben desechar los componentes usados del kit de acuerdo con las normas sanitarias, de seguridad y ambientales locales. Procedimiento para esputos u otras muestras respiratorias viscosas
Se recomienda usar el Kit de digestión/descontaminación de muestras BD BBL™ MycoPrep™ para procesar las
muestras micobacterianas (N.º de catálogo 240862) con el protocolo MycXtra® para la preparación de muestras de
esputo. El procedimiento descrito a continuación ha sido modificado para adaptarse a los requerimientos de la muestra
para su procesamiento con el kit MycXtra®.
Precauciones
El reactivo NALC-NaOH del Kit de digestión/descontaminación de muestras BD BBL™ MycoPrep™ para el
procesamiento de muestras micobacterianas contiene un álcali fuerte y puede causar quemaduras graves. Quítese
inmediatamente toda prenda que esté contaminada. Debe usar guantes y protección ocular/facial. El NaOH es un
irritante ocular y cutáneo. En caso de contacto con los ojos o la piel, aclare inmediatamente con un sistema de lavado
ocular o agua del grifo durante un mínimo de 15 minutos y solicite asistencia médica. En caso de ingestión, tome leche,
clara de huevo o grandes cantidades de agua y solicite asistencia médica.
Aviso: Rompa la ampolla cerca de su parte central una vez solamente. No manipule más la ampolla, ya que el recipiente
de plástico se podría perforar y podrían causarse daños.
Instrucciones de almacenamiento: Cuando lo reciba, almacénelo a 15–30 °C. No lo congele. No lo abra hasta que
esté listo para usar.
Deterioro del producto: No use los reactivos si las ampollas están rotas o si hay signos visibles de deterioro. No use el
tampón fosfato si los paquetes están rotos o sin precintar.
Procedimiento
1. Prepare la solución de tampón fosfato BBL™ MycoPrep™. Vierta el contenido de una bolsita de tampón fosfato en
un recipiente de vidrio con tapa de rosca y llénelo hasta la línea de 500 mL con agua de calidad para biología molecular. Esterilícelo en autoclave, con la tapa aflojada, a 121 ° C durante 15 min. Enfríe a temperatura ambiente y apriete la tapa. 2. Afloje con cuidado la tapa de rosca del frasco de reactivo de BBL™ MycoPrep™. Localice la ampolla en el recipiente, exprima el exceso de aire del frasco y apriete la tapa. Con el frasco en posición vertical, apriete el frasco hasta que se rompa la ampolla. Agite suavemente para disolver el NALC. Evite una agitación excesiva. UNA VEZ ROTA LA AMPOLLA, UTILICE EL REACTIVO EN LAS SIGUIENTES 24 horas. 3. En una cámara de seguridad biológica (de clase 2 como mínimo), usando un tubo de centrifugadora graduado de 50 mL con tapón de rosca, añada la muestra y dos veces su volumen de solución de NALC-NaOH activada estimando el volumen del esputo. Por ejemplo: añada 4 mL de solución de NALC-NaOH activada para una muestra de aproximadamente 2 mL. 4. Cierre el tubo de centrifugadora y mézclelo en un agitador vorticial hasta que se haya solubilizado la muestra. Si la muestra es especialmente viscosa, añada más solución de NALC-NaOH y repita la mezcla. 5. Deje la muestra a temperatura ambiente durante 15 min agitándola de vez en cuando ligeramente. 6. Añada la preparación de tampón fosfato hasta la marca de 35 mL al tubo de centrifugadora y mézclelo. Centrifugue 7. Decante con cuidado todo el líquido sobrenadante. Usando una micropipeta, retire con cuidado todo el sobrenadante 8. Añada 800 µL de la preparación de tampón fosfato y vuelva a suspender el sedimento. Transfiera toda la cantidad a 9. Siga el procedimiento de BAL desde el paso 3. Español–3
Para uso diagnóstico in vitro
MycXtra®
Características de rendimiento y limitaciones
Selectividad analítica
Usando un kit de MycXtra®, se extrajo ADN a partir de BAL, esputo y otras muestras respiratorias clínicas en las cuales
se habían identificado los siguientes microorganismos mediante cultivo o por microscopia: Aspergillus fumigatus,
Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, género Penicillium y Pneumocystis jirovecii. El ADN se detectó usando el kit
Myconostica FXGTM : RESP (Asp +) para la detección rápida por PCR en tiempo real del ADN de Aspergillus y
Pneumocystis en muestras respiratorias clínicas.
Eliminación de sustancias que podrían interferir
Ciertos fármacos frecuentemente usados en el tratamiento de enfermedades respiratorias, como la tobramicina, la
colistina sulfato, la dornasa (ADNasa), el salmeterol, así como otros materiales, por ejemplo la solución salina normal
(0,9%), la heparina y el ácido tánico, pueden inhibir los ensayos de PCR en tiempo real. El proceso de extracción
MycXtra® los elimina completamente. Los estudios de evaluación del procedimiento realizados utilizando muestras
clínicas indicaron que en las muestras respiratorias existen algunos inhibidores de PCR, de naturaleza desconocida, que
no se eliminan durante el proceso de extracción.
Límites de detección y repetibilidad
Todos los datos: Concentración de esporas frente al valor de Ct ADN de muestras que contenían tan sólo 10 esporas. Dos operadores extrajeron las esporas de Aspergillus FXGTM : RESP (Asp +) que tiene un límite de detección de A. fumigatus. Los resultados se muestran en la figura Figura 1. Concentración de esporas de Aspergillus fumigatus frente al valor de Ct mediante PCR en tiempo real.
Reproducibilidad
Between batch extraction comparison
independientes usando tres lotes de kits MycXtra® con una suspensión estándar de esporas de Aspergillus fumigatus. A continuación se realizó PCR en tiempo real, (Asp +) para determinar la variabilidad entre lotes y dentro de cada lote en la extracción de ADN de Aspergillus fumigatus. Los resultados Extractions
Figura 2. Variación entre lotes y dentro de cada lote.
Evaluación del rendimiento

Detección de las especies de Aspergillus
Se utilizaron muestras respiratorias (BAL) obtenidas de dos hospitales, extraídas con el kit MycXtra® y almacenadas para
evaluar el rendimiento del kit MycAssayTM Aspergillus con muestras clínicas. Se realizaron comparaciones con el
diagnóstico clínico.
Se determinó el valor de corte de un Ct de 36,0 después de la revisión de un conjunto de datos de muestras procedentes
de diferentes lugares y de diferentes poblaciones de pacientes. Se evaluaron diferentes puntos de corte con respecto a
la probabilidad de diferenciar entre el estado de de enfermedad y el estado de ausencia de enfermedad.
PCR frente al diagnóstico clínico
De las muestras analizadas, el 0,8% contenía inhibidores de la PCR, tal como indicó el IAC, tras la extracción con el kit MycXtra®. Español–4
Para uso diagnóstico in vitro
MycXtra®


Detección de Pneumocystis jirovecii
Se utilizaron muestras clínicas de lavado broncoalveolar (BAL) obtenidas en dos hospitales, extraídas con el kit MycXtra®
y almacenadas, para evaluar el rendimiento del kit MycAssayTM Pneumocystis. Se realizó una comparación de los
resultados de la PCR con los de la microscopia de inmunofluorescencia.
Diagnóstico mediante PCR frente a diagnóstico mediante microscopia


La tabla representa datos obtenidos de pacientes con diagnóstico de infección por el VIH, pacientes sin infección por el
VIH y pacientes con estado de VIH indeterminado. Los pacientes con neumonía por Pneumocystis tienen cantidades
muy variables de microorganismos detectables; cuanto menor es el valor de Ct, mayor es la probabilidad de enfermedad.
Los pacientes con infección por el VIH y neumonía por Pneumocystis tienden a tener cifras más altas de
microorganismos detectables que los pacientes que no están infectados por este virus, pero existe una superposición
considerable. La gráfica de dispersión de la figura 3 a continuación demuestra esta superposición. Para proporcionar
información más completa, dado que el conjunto de datos de la tabla incluía a pacientes cuyo estado de VIH era
desconocido, en la figura 3 se incluye la gráfica de dispersión para este grupo (columna 3):
1 = VIH +/Microscopia + ; 2 = VIH –/Microscopia + ; 3 = VIH desconocido/Microscopia + ; 4 = Todas las microscopias –
Figura 3: Gráfica de dispersión de los valores de Ct obtenidos del ADN extraído de muestras respiratorias de pacientes.
Se describen cuatro grupos.
Myconostica Limited, South Court, Sharston Road, Sharston, Manchester, M22 4SN, Reino Unido. Teléfono: +44 (0) 161 998 7239 Fax: +44 (0) 161 902 2496 Correo electrónico: [email protected] Español–5

Source: http://myconostica.co.uk/useruploads/files/ifu/mycxtra_ifu_v_3_1_11mar10_es.pdf